Hilfe am Mikroskop

[Peter-1]

Liebe Fotografen,

es will bei mir einfach nicht gelingen, brauchbare Bilder von Kristallen aufzunehmen.
Meine Ausrüstung ist wie folgt:
Olympus BH-2 Mikroskop mit Auflichteinheit UMA für Hell- und Dunkelfeld. Dazu Objektive der Reihe Neo SPlan 5x bis ULWD 80x, Projektiv NFK 1,67x und Sony NEX 3N. Die Arbeitsabstände sind ausreichend für zusätzliches Seitenlicht (matt). Als Beispielbild eine Aufnahme von Curit (Bildbreite 0,17mm).
Ich wütde mich überAnregungen freuen.

Peter

[loparit]

Um etwas genaueres sagen zu können muss man mehr Informationen habe!

Welche Kamera?
Welches Objektiv?
Welcher Stackabstand?
Welche Software?
welche Beleuchung?
wie gestackt?

usw.

Gruß
Edgar Müller loparit

[Josef 84,55]

Hallo Peter,

für die Bildbreite von 0,17 mm ist das Bild wirklich gut!
Ich denke das Hauproblem ist die sehr gleichmäßige Beleuchtung. Im Hellfeld gibt es gar keine Schatten und im Dunkelfeld auch kaum weil das Licht von einem kompletten Kreis um das Objektiv kommt, was die Motive etwas "langweilig" beleuchtet. Vielleicht könnte man mit Sektorblenden den Strahlengang einschränken. Deine Zusatzbeleuchtung geht schon in diese Richtung, wenn aber die Hauptbeleuchtung schon alle Schatten beseitigt wird es dennoch recht kontrastarm.
Ich habe auch ein BH-2 mit den NeoDPlan Objektiven und habe zum fotografieren den Stereotubus durch einen Balgen ersetzt, ohne Projektiv. Da ich aber hier noch keine Objektive mit langem Arbeitsabstand habe, nutze ich es bisher nur für Anschliffe.

Grüße Josef

[Peter-1]

Hallo Edgar,

1. Kamera Sony NEX 3N
2. Olympus ULWD Neo SPlan 80/0,75
3. 1µm
4. HeliconFocus Pro
5. LED für Dunkelfeld und seitliches Zusatzlicht
6. Methode B bei HF mit Radius 40 , Glättung 3

Welche Schlüsse kann man daraus ziehen?
Peter

[Mabu]

Hallo,

ich könnte mir vorstellen, dass die Methode C in Helicon Focus ein besseres Bild ergibt.

Ansonsten ist das Bild für eine Bildbreite von 0,17mm gut.

Gruß,
Marko

[Matthias Reinhardt]

Hallo Peter,
meiner Meinung nach eignet sich die Fotovorlage nicht für ein Top Foto.
Zu viele Nadeln die kreuz und quer liegen. Da hat das Stackingprogramm seine Schwierigkeiten mit.
Um die Schlieren um die Nadeln herum weg zu bekommen, würde ich auch mal mit Methode C versuchen.
Zeig uns doch mal bitte ein Bild von einem anderen Motiv wie die XX auf eine Ebene liegen bei einer ähnlichen Vergrößerung.
Bei solch einer starken Vergrößerung geht viel Licht drauf. Wie lange waren deine Belichtungszeiten??

Gruß
Matthias

[loparit]

Hallo Peter,

Nun was schließe ich daraus!
Ich versuche aus den Angaben den idealen Stackabstand zu berechnen, überlege dann wieviele Aufnahmen hat er gemacht. Denn daraus und aus dem eigentlichen Motiv ergibt sich eventuell die Methoden zum Stacken usw.

Dafür brauche ich die Angaben zum Sensor bzw. welche Kamera, welches Objektiv usw.
Die anderen Infos eben um zu sehen wo hast du eventuell Fehler gemacht.
Wobei man da sowieso nicht unbedingt von Fehlern reden kann, denn 0,17 mm Bildbreite ist schon äußerst schwierig und dann noch nadelige Kristalle, welche kreuz und quer stehen ist nicht einfach für die Software beim zusammenrechnen.

Also kurz gesagt, ist der Stackabstand meines Erachtens zu groß! (berechneter Wert idealer Stackabstand mit dem Objektiv und der Kamera und der Bildbreite 0,00017 mm)

Dann wie Matthias und auch MABU schon richtig erkannt und geschrieben hat ist die Stackmethode die falsche, HeliconFokus C oder mit ZereneStacker

Dann könnte es eventuell etwas besser werden, wobei wir bei solchen Vergrößerungen an die Grenze des machbaren kommen.

Gruß
Edgar Müller -loparit-

[Peter-1]

Danke für die guten Ratschläge !

Mit HeliconFocus Methode C habe ich selbstverständlich auch versucht und noch schlechtere Ergebnisse erhalten. Die Kristalle sind der Teufel. Zum Stackingabstand kann ich nur sagen, dass es ein Wunsch ist unter 1µm zu kommen, vielleicht 0,7µm aber für weniger müßte ich einen extra Tisch am Mikroskop konstruieren.
Ich mache erst mal eine Denkpause 
Ein Bild einer Nadel mit der markanten Rille ist mir noch gelungen.

Peter

[Fabian99]

Hallo Peter,

Die Bildbreite von 75mum ist korrekt? Dann ist das Bild dicht an perfekt. Was duch begrenzt ist scheinbar ein Farbrauschen und die Auflösung nach Abbe. Später mehr, habe gleich einen Termin.

Lg

[Peter-1]

Hallo Fabian,

ja die Bildbreite ist korrekt. Das Farbrauschen kommt durch die hohe ISO Zahl. Ich wollte die Bel.Zeit nicht über 1sec haben und daher die ISO auf 1600 gestellt. Hätte ich nicht machen sollen.

[Fabian99]

Hallo,

Ich habe das Bild mit Gimp in Lab zerlegt, im L-Kanal den dinklen Bereich etwas "gezogen" um den kontrast zu erhöhen und etwas selektiv "selektiver Gauss Weichzeichner" gemacht. im L-Kanal mit d=3 im a und b Kanal mit 6. die größten Artefakte waren auf der Blau gelb Achse im unteren Bereich. Die Werte sind nicht fix und nur du kannst das Bild bewerten. Aber die Richtung sollte es sein.

Die Farbflächen sind etwas zu konstant für mein Empfinden, aber  vielleicht geht das am Original-Bild besser.

LG

[Fabian99]

Dein Neoplan sollte eine NA von 0.75 haben und du arbeitest gegen Luft.

Somit ist dein Auflösungsvermögen bei 550nm Wellenlänge (Zentrum des sichtbaren Bereichs) etwa 0.55µm/0.75 =660nm ohne die Betrachtung weiterer Bildfehler.

Zeichne mal einen Kreis mit dem Durchmesser 1,3µm ein . Dieser Kreis spielt optisch zum Zentralpunkt mit.

Siehe auch:
https://de.wikipedia.org/wiki/Aufl%C3%B6sung_(Mikroskopie)
und
https://de.wikipedia.org/wiki/Rayleigh-Kriterium


LG

[Lynx]

Hoi

kleine Randnotiz. Bin mir nicht sicher, was die Tatsache macht, dass es sich nicht um eine optische Abbildung sondern um einen Scan (in z-Richtung) mit anschließender Verrechnung der Bilder handelt.

Zum einen hat der Algorithmus eine gewisse Anzahl mehr Punkte zur Verfügung als das Einzelbild, um die Kante aus einem Kontrast zu rechnen (das ist jetzt abstrakt formuliert, was die Algorithmen tun sollten) also mehr Information, als in einem Einzelbild. Da kann ein Algorithmus auch auf Sub-Abtastfrequenz (Pixel) Kanten bestimmen - weil mehr Information vorliegt. Diese Kanten sind aber nicht notwendigerweise "echt" haben aber dieselbe Wirkung auf das Bild wie echte Kanten.

Zum anderen gehen aber auch die Störungen von mehr Bildern in den Algorithmus mit ein, und das hängt dann von Kontrast, Rauschen Farbfehlern etc ab, was genau passiert. Hier macht u.u. mehr Information das Bild schlechter.

Wichtig: Die Auflösung hinten unten im Endbild ist abhängig vom gesamten Bildentstehungsprozess also incl. der Verrechnung. Unter Umständen ist also garnicht die Optik limitierend sondern die Rechnung...

Gruß, Martin

[Fabian99]

Hallo,

ja da hast du recht - Subpixel ist möglich. Aber du änderst zwischen den Aufnahmen etwas. Die Interpolation gilt meiner Meinung nach nur bei der mehrfachen Abtastung eines Objekts (= ein Bild). Salopp gesprochen weist du nicht, ob die Änderung aus der Änderung der Fokusebene kommt oder aus der Auflösung. Wobei der Fokus rund 3x (+/- einiges) höher sein sollte als der Durchmesser der Beugung.

Daher bin ich nach wie vor der Meinung, das Bild ist gut :-) für die Vergrößerung. Die Bildbreite sind rund 1,5 Haarbreiten!!!

LG

[Lynx]

Jo, an sich ist das Bild gut.

Vermutlich könnte eine andere ISO bzw andere Lichtverhältnisse was bringen, weil es dann dem Algorithmus leichter wird, seine Arbeit zu machen.... Optisch geht mE nicht viel.

Wegen Abtastung: Im allgemeinen ist das der Punkt, bei einem Scan ändert sich was. Eigentlich müsste ggf. sogar zunächst der Datensatz als Zeitreihe behandelt werden, um Drift etc (also Einflüsse aus dynamischen Veränderungen) zu korrigieren. Dann bekommst Du Deine Datenpunkte, die zu einem Gesamtensemble zusammengefügt werden. Auf diesem Gesamtensemble machst Du dann die Rechnung, d.h. die Ursache einer Kante stammt dann aus dem Gesamtensemble. Bei statischen Proben wie hier macht das wenig aus. Aber für Laser Scanning Microscopy an (lebenden) Proben gibt es unte Umständen interessante Artefakte durch z.B. Bleichen oder auch Aufheizung von einer Scanebene zur nächsten etc. Insofern muss man sich bewußt sein, das gestackte Bilder eben nicht einer optischen Abbildung entsprechen.
Auffällig wird soetwas bei LSM, AFM, EM etc vorallem immer dann, wenn es an die Auflösungsgrenzen geht. Wer will kann versuchen, für sein Gesamtsystem mal eine Transferfunktion zu bestimmen. Dazu fluoreszierende Nano-Latexkügelchen abbilden (niedrige Konzentration z.B eingebettet oder auf einer korrugierten Unterlage). Dann den Stack rechnen und das Bild auswerten. Spannende Sache aber leider sehr aufwendig...

Gruß, Martin